铁死亡是什么，如何检测？您要的“一文通”来了！

铁死亡 (Ferroptosis)，是一种新型的调节性细胞死亡形式，自被发现就引起了研究狂潮，热度不减。近年来铁死亡相关论文也一直在勇攀高峰，今天，小编就带大家简单了解一下铁死亡是怎么回事儿~

多细胞生物中，调节性细胞死亡过程 (RCD) 是细胞维持组织形态和功能必不可少的稳态机制。此前研究较多的调节性细胞死亡包括三大类：细胞凋亡、自噬和坏死。

“铁死亡”这一概念最早在 2012 年由 Dr. Brent R Stockwell 提出，它是一种铁离子依赖的新型细胞调节性死亡，在细胞形态学上，生化特征区别于细胞凋亡、坏死、自噬。从机制上简单来说，铁死亡是细胞膜上铁依赖性的高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，诱导的细胞死亡。

近年来，铁死亡相关研究是如火如荼，前途一片光明。今年 1 月，广州医科大学唐道林教授团队在 Nat Rev Clin Oncol 上发表题为 Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer 的综述。Emmm，看标题就气势如虹。接下来，和小编一起来“开开眼界”吧。

图 1. 铁死亡在癌症中的作用^[1]

在这篇高分综述中，关于铁死亡，作者提出了几个观点：

1、铁死亡 (Ferroptosis) 是一种调节性的细胞死亡，依赖于铁介导的氧化损伤。

2、铁死亡可以通过两条主要途径：外源性 (转运蛋白依赖) 途径，内源性 (酶调控) 途径。

3、铁积累的增加，自由基的产生，脂肪酸供应与脂质过氧化物增加是诱导铁死亡的关键。

铁死亡的主要途径

■ 外源性 (转运蛋白依赖) 途径

外源性途径是通过抑制细胞膜转运蛋白如胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白 (System xc^-)，或激活铁转运蛋白血清转铁蛋白和乳转铁蛋白启动的。

1、抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白来促进铁死亡

System xc^- 是细胞内重要的抗氧化体系，该系统由 2 个亚基组成，SLC7A11 和 SLC3A2。SLC7A11 负责主要的转运活性，对胱氨酸和谷氨酸有高度特异性，而  SLC3A2 则作为伴侣蛋白。System xc^- 以 1:1 的比例用胞内谷氨酸来换取胞外的胱氨酸 (Cys₂)，胱氨酸在谷氨酸半胱氨酸连接酶 (GCL) 和谷胱甘肽合成酶 (GSS) 的催化作用下合成谷胱甘肽 (GSH)。

GSH 是膜脂修复酶——谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX4) 的还原性辅因子。抑制 System xc^- 的活性会抑制胱氨酸的吸收，影响 GSH 的合成，继而导致膜脂修复酶 GPX4 活性降低，细胞抗氧化能力降低，从而促进铁死亡。

2、铁转运蛋白与铁 “超载”

增加铁的吸收，减少铁的储存和限制铁的外流都会导致铁积累增加，然后通过一系列的信号传导途径来促进铁死亡。

转铁蛋白 (血清转铁蛋白或乳铁蛋白) 通过转铁蛋白受体 (TFRC) 介导铁摄取，FTH1/FTL (铁蛋白组件) 通过自噬降解可以增加铁的水平，这些都可以促进铁死亡。而 SLC40A1 介导的铁外流和外泌体介导的铁蛋白输出会抑制铁死亡。

图 2. 铁死亡的分子机制^[1]

(红色框：GSH-GPX4 抗氧化系统在铁死亡途径中起重要作用；蓝色框：铁积累与铁死亡；绿色框：脂肪酸积累与铁死亡调控；紫色框：甲羟戊酸 (MVA) 途径抑制 GPX4 的合成。)

■ 内源性 (酶调控) 途径

内源性途径是通过阻断细胞内抗氧化酶 (如 GPX4) 激活的。

1、抑制 GPX4 诱导铁死亡

脂质过氧化物积累是铁死亡的标志。GPX4 可将细胞毒性脂质过氧化物 (L-OOH) 还原为相应的醇 (L-OH)，抑制 GPX4 活性会导致细胞膜脂质过氧化物的积累。 

直接抑制：如 RSL3 作为铁死亡诱导剂，可直接作用于 GPX4 并抑制其活性，因此降低了细胞的抗氧化能力并积累了 ROS，从而导致铁死亡。

间接抑制：前面提到的抑制 GSH 的合成；硒代半胱氨酸是 GPX4 活性基团的必需氨基酸之一，抑制甲羟戊酸途径可下调硒代半胱氨酸 tRNA 的成熟来影响  GPX4 的合成，从而影响 GPX4 的活性并诱导铁死亡。

2、其他酶的调节途径与脂肪酸积累

乙酰辅酶 A 羧化酶 (ACAC) 介导的脂肪酸合成，脂质吞噬 (Lipophagy) 介导的脂肪酸释放，可诱导细胞内游离脂肪酸的积累，促进铁死亡。

长链脂肪酸辅酶 A 连接酶 4 (ACSL4) 和溶血磷脂酰基转移酶 3 (LPCAT3) 促进多不饱和脂肪酸 (PUFA) 掺入磷脂中形成多不饱和脂肪酸的磷脂 (PUFA-PL)。PUFA-PLs 易受脂氧合酶 (ALOXs) 介导的自由基引发的氧化作用。这种氧化作用最终会导致脂质双层的破坏并影响膜功能，从而促进铁死亡。

铁死亡的研究策略

上文介绍了铁死亡的基本途径。铁死亡有哪些研究策略呢？下面以文献 Energy-stress-mediated AMPK activation inhibits ferroptosis 为例。

作者团队建立了特定病理过程 (铁死亡) 的细胞模型，使用多种诱导剂和抑制剂，以及多种检测方法证明铁死亡与 AMPK 的调控关系，并建立了 AMPKα1/α2 的基因敲除细胞系 (AMPK DKO)，验证 AMPK 缺失对铁死亡敏感性的作用机制。

■ 确立铁死亡病理模型

1、能量应激 (Energy stress) 抑制铁死亡

首先，研究人员探索了永生化小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs) 中，葡萄糖饥饿条件对 Erastin 诱导的铁死亡的影响。首先，证明 Erastin 诱导铁死亡：Caspase-3 或 PARP 裂解均未下调 (细胞凋亡的标志)，而且铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1 可以逆转 Erastin 诱导的细胞死亡。最初他们预想，葡萄糖饥饿的条件会增强  Erastin 诱导的铁死亡，结果恰恰相反：葡萄糖饥饿很大程度上逆转了 MEFs 中引起的铁死亡。

图 3. 能量应激抑制铁死亡

(a. Erastin 诱导 MEFs 铁死亡；b. 葡萄糖饥饿条件下 MEFs 应对铁死亡的变化；c-d. CCK8 法和脂质过氧化测定法检测不同能量应激条件下 MEFs 应对铁死亡的变化。)

作者团队进一步选择了其他可诱导或模拟能量应激的化合物，包括 2-脱氧葡萄糖 (2-DG)、阿卡地新 (AICAR)、A769662。这些化合物也显著抑制了由 Erastin 处理引起的脂质过氧化和铁死亡。综上所述，能量应激抑制了铁死亡。

2、AMPKα1/α2 的基因敲除细胞系建立

上述模拟或诱导能量应激的化合物均会激活 AMPK，那么 AMPK 是否参与能量应激介导的铁死亡抑制？MEFs 中，如图 4a-b，AMPK 双敲除 (DKO) 可以完全逆转诱导能量应激的化合物对 Erastin 诱导的铁死亡的抑制作用。

紧接着，如图 4c，作者又验证了一组细胞系中的基础 AMPK 激活状态 (p-AMPK Thr172 为激活标志) 与铁死亡 (SLC7A11 的表达水平) 相关性。并且如图 4c-d 所示，SLC7A11 高表达细胞相对于低表达细胞对铁死亡的抵抗力更高，值得注意的是，虽然在 SLC7A11 高表达细胞中 AMPK 激活状态与铁死亡的敏感性无关，但 SLC7A11 低表达细胞中 AMPK 的激活与铁死亡敏感性呈负相关。以上数据表明能量应激部分通过 AMPK 抑制了铁死亡。

图 4. 能量应激抑制铁死亡与 AMPK 相关

(a. AMPKα1/α2 双敲除细胞系的建立；b. 不同能量应激条件下 AMPK DKO 细胞对铁死亡的响应；c. 不同细胞系的 AMPK 激活与 SLC7A11 的基础表达水平；d. 通过 CCK8 法和脂质过氧化测定法检测，SLC7A11 表达与细胞对铁死亡的敏感度相关。)

3、AMPK 失活使癌细胞对铁死亡敏感

AMPK 在高基础 AMPK 磷酸化水平的癌细胞系中是否会促进铁死亡抗性？AMPK 抑制剂 Compound C 可下调 AMPK 的激活，如图 5a-b，Compound C 处理使 ACHN 细胞 (高基础 AMPK 磷酸化的抗铁碱化细胞系) 对 Erastin 或胱氨酸耗竭变敏感。透射电子显微镜 (TEM) 的结果也显示，ACHN 细胞中，Compound C 与 Erastin 或胱氨酸耗竭共同处理导致线粒体收缩，膜密度增加，但细胞核中没有明显的 DNA 片段化 (铁死亡的细胞特征形态特征)。这表明 AMPK 的抑制使癌细胞对铁死亡敏感。

图 5. Erastin 或胱氨酸耗竭条件下 ACHN 细胞对铁死亡的敏感性

(a-b. CCK8 法和脂质过氧化测定法检测，Erastin 或胱氨酸耗竭条件下 ACHN 细胞对铁死亡的敏感性；c. 透射电子显微镜 (TEM) 分析)

综上所述，作者团队“意外”发现能量应激对铁死亡的抑制作用，并且这种抑制作用部分是通过 AMPK 的激活实现的。

总结：

1、GSH-GPX4 抗氧化系统在铁死亡途径中起重要作用。脂质过氧化物增加，转铁蛋白等介导的铁的积累，以及细胞内游离脂肪酸的积累都可以诱导铁死亡。

2、Hyemin Lee 等人使用铁死亡通路相关的抑制剂/诱导剂，以及建立了 AMPK 敲除细胞系，证明铁死亡与 AMPK 之间的调节关系。

3、常见的检测铁死亡的实验方法：铁死亡相关细胞存活分析，如文中的 CCK8 法 (其他细胞活力检测方法还包括 MTT 法，台盼蓝染色等)。

4、除了细胞活力测定，脂质氧化水平的测定 (文中的 C11 BODIPY 581/591 染色)，GSH 测定，线粒体 ROS 测定，以及 GPX4 活性测定，电镜下线粒体的变化的监测，特异性靶标分子的分析 (WB、IHC、IF 等) 也是常用的检测手段。

相关产品

Erastin

铁死亡诱导剂，结合且抑制电压依赖性阴离子通道 (VDAC2/VDAC3)。

RSL3

铁死亡诱导剂，可直接降低 GPX4 的表达。

L-Cystine

一种氨基酸，在细胞调节过程中起着重要作用，胱氨酸耗竭会诱导铁死亡。

Ferrostatin-1

选择性的铁死亡抑制剂，人工合成的抗氧化剂，通过还原机制来防止膜脂的损伤，从而抑制细胞死亡。

AICAR

腺苷类似物，也是一种 AMPK 激活剂，调节葡萄糖和脂质的代谢。

A-769662

有效的，可逆的 AMPK 激活剂，EC₅₀ 值为 0.8 μM。

Compound C dihydrochloride

选择性 AMPK 抑制剂，可参与细胞自噬以及铁死亡。

CCK8 试剂盒 

细胞活性和细胞毒性检测的快速、高灵敏度试剂盒。

Thiazolyl Blue (‍‍MTT)‍‍

可用于细胞增殖，活性毒性的检测。

H2DCFDA

可渗透细胞的，用于检测细胞内活性氧 (ROS) 水平的探针。

JC-1 试剂盒

用于测量线粒体膜电位的荧光探针试剂盒。

TMRM Perchlorate

亲脂性红色荧光染料，可用于线粒体膜电位检测。

铁死亡化合物库

收集了 500+ 种文献报道的具有诱导或抑制铁死亡相关的化合物及与铁死亡密切相关的靶点对应的化合物，可以用于铁死亡机制及相关疾病的研究。

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缩写

RCD: Regulated cell death

System xc^-: The cystine/glutamate transporterACAC:  Acetyl-CoA carboxylaseACSL4：Acid-CoA ligase 4GSH: Glutathione  GCL: Glutamate-cysteine ligase  GSS:  Glutathione synthetase  Cys₂：CystineGPX4: Glutathione peroxidase  TFRC: Iron-loaded serotransferrin-transferrin receptor  FTH1/FTL: Ferritin componentWB：Western BlotIHC: ImmunohistochemistryIF: Immunofluorescence

参考文献 

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1. Daolin Tang, Xin Chen, Rui Kang, Guido Kroemer. Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2021 Jan 29.
2. Hyemin Lee, et al. Energy-stress-mediated AMPK activation inhibits ferroptosis. Nat Cell Biol. 2020 Feb; 22(2): 225-234.

3. Jie Li, Feng Cao , He-Liang Yin, et al. Ferroptosis: past, present and future. Cell Death Dis. 2020 Feb 3;11(2):88.4. Caicun Zhou, Xuefei Li, et al. Targeting ferroptosis for cancer therapy: exploring novel strategies from its mechanisms and role in cancers. Transl Lung Cancer Res. 2020 Aug;9(4):1569-1584. 

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